ПОЛУЧЕНИЕ КОНТРОЛЬНЫХ ПЛАЗМИД ДЛЯ СКРИНИНГА МУТАЦИЙ В ГЕНЕ РЕЦЕПТОРА ЛИПОПРОТЕИНОВ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ С ПОМОЩЬЮ АМПЛИФИКАЦИИ ДНК В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ
П.Б. Дроздова, учащ.
Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Отдел молекулярной генетики; Санкт-Петербургский городской Дворец творчества юных. Санкт-Петербург, Россия

Успешность внедрения диагностических тестов в практику медицины во многом зависит от удобства их использования и возможности одновременно применять их для большого числа образцов. В полной мере этим критериям отвечают методы поиска мутаций с помощью амплификации ДНК в режиме реального времени, не требующих проведения электрофоретического анализа. Семейная гиперхолестеринемия (СГ) является частым моногенным заболеванием человека, приводящим к атеросклерозу и инфарктам миокарда. Она обусловлена мутациями в гене рецептора липопротеинов низкой плотности (ЛНП). Одной из часто встречающихся мутаций этого гена в Санкт-Петербурге является трехнуклеотидная делеция 652-654delGGT, приводящая к отсутствию глицинового остатка в 197 положении зрелого белка и к мисфолдингу белка и потому часто называемой G197del. Ранее был предложены праймеры и зонды для обнаружения делеции 652-654delGGT с помощью ПЦР в режиме реального времени. Нашей задачей было получение плазмид с нормальным и мутантным аллелем гена рецептора ЛНП, которые могли быть использованы в качестве контролей в этих экспериментах.
Для решения поставленной задачи мы амплифицировали ДНК гетерозиготного по мутации G197del пациента с помощью ПЦР и лигировали ДНК с линеаризованной плазмидой pBluescript. Лигазной смесью трансформировали клетки кишечной палочки штамма DH5альфа. Рекомбинантов отбирали на среде с ампициллином и хромогеном X-Gal. Колонии, несущие вставку, были белого цвета, а без вставки – голубого. Далее клоны с мутантным аллелем идентифицировали методом гетеродуплексного анализа.

129

« Предыдущая     Следующая » 

119 
120 121 122 123 124 125 126 127 128